SELEX技术筛选艰难梭菌毒素A的适体生物传感器

来源: 发布时间：2014-07-17  

　　由于生物传感器检测微生物毒素具有简便、快速等特点，受到了科研工作者的广泛关注，在生物分析、临床诊断、分子识别等方面都显示出了广阔的应用前景。但抗毒素制备复杂，费时，不利于临床应用，而适体是单链的寡核苷酸,它通过折叠成稳定的三维空间结构去与各种靶目标表面相结合,以发挥分子识别的作用，因此适体的研究为我们探讨生物分子间的相互作用提供了新线索。近年来,利用SELEX筛选的核酸适体不断被应用于包括疾病诊断和治疗的生命科学的各个领域。适体既可发挥类似抗体的功能,又可弥补抗体的不足,具有靶分子范围广、亲和力和特异性高、性质稳定、制备简便等特点。
　　生物传感器在不同修饰条件下的具有不同的电属性。当电极表面没有电子介体存在时，裸的丝网印刷电极和Nafion修饰电极都没有明显的峰电流被观察到。但是当硫堇被Nafion通过离子交换固定到电极表面时，有一个对称的氧化还原峰被观察到，它暗示硫堇作为电子介体表现出好的电子传导能力，因此在电极表面有一个近似的氧化还原反应发生。当GNPs被固定在Nafion-Thi修饰的电极上后，峰电流明显增加，这是因为GNPs能够作为电子传递通道，促进电子的转移。但是当纳米金通过金-硫作用将巯基化的适体探针共价固定到电极上会导致峰电流降低，这是因为适体探针部分地阻碍电子的传递。HRP标记的适体探针与修饰的生物传感器杂交，会引起氧化峰电流迅速降低而还原峰电流迅速增加。这表明HRP参与了电极表面的酶促反应。在适体传感器和TOA发生反应后，还原峰电流进一步降低，这是因为TOA的引入导致了适体的构象发生变化，引起HRP标记的适体探针从电极表面脱落，从而引起峰电流强度的降低。
　　温度是影响生物反应的一个重要因素。适体与蛋白的活性也与温度有直接关系，温度升高时，蛋白的反应速率增加，但高温会使蛋白变性而失活。我们在4~45℃范围内考察了电流响应值与温度的关系，实验表明，随着温度的升高，催化电流增大，当温度达到37℃时，催化电流达到大值：当温度超过45℃时，响应值呈下降趋势，这可能是温度过高，导致部分蛋白或适体失活或流失造成。
　　基于适体开关的艰难梭菌TOA生物传感器能有效减少多种其它毒素的干扰，但艰难梭菌毒素B会影响传感器对TOA的检测。这是因为TOB的N'氨基端与TOA有64%的同源性，会导致TOB与所筛选的TOA适体结合。虽然TOB会影响TOA的检测，但TOB的存在也可以证明艰难梭菌感染。因此我们所制造的生物传感器具有高的特异性。
　　随着SELEX技术的不断丰富和完善，适体生物传感器在微生物感染诊断的研究得到了飞速发展，但在其性能完善与应用推广仍面临着许多需要继续研究的问题。寻找高特异性的新适体，提高适体生物传感器的灵敏度和适用性，加速适体传感器检测过程的快速化、自动化已成为适体生物传感器的研究的主要方向。

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