氨基酸的荧光检测方法

来源: 发布时间：2014-11-17  

　　荧光检测法,是通过使氨基酸与衍生试剂发生反应,生成的氨基酸衍生物能够用荧光分光光度计分析,根据标准曲线从而得知被测氨基酸的含量。通常能使氨基酸生成产生荧光衍生试剂有邻苯二甲醛(OPA)、丹酰氯(DANSYL-Cl)、氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)。邻苯二甲醛(OPA)OPA衍生法产生于1971年,在早先采用的阳离子柱后衍生法中,聚苯乙烯磺酸型的阳离于交换树脂被洗脱液中的钠离子平衡:R—SO3H十Na+=R—SO3Na十H+.在酸性溶液中,带正电荷的氨基酸被树脂的一SO3-基团吸引而束缚在树脂上,随着洗脱液pH的不断升高,氨基酸不断失去正电荷,与树脂的结合力不断减弱,终被依次洗脱下来,被洗脱下的氨基酸在邻苯二甲醛一巯基乙醇作用下生成荧光衍生物(仲氨酸需氧化开环后再衍生)。
　　OPA柱后衍生法,在上述色谱条件下需用90min完成一次色谱分离,检出限50×10-12mol,测定限l000×10-12moI,重现性(保留时间)0.2%,分析精度3%—5%(C.V)。由于该法是程序化柱后衍生,OPA以极快的速度与氨基酸反应生成发荧光团物质,又在很短的时间内进入灵敏度很高的荧光检测器检测,消除了柱前手动衍生使衍生物不稳定的因素,该方法具有效高的分辨率和灵敏度。但OPA衍生剂不能直接与二级氨基酸反应,要先用次氯酸钠氧化开环后再用OPA衍生,这不仅使衍生手续繁杂,而且设备部件增多,仪器造价过高。此外,分析历程过长,仪器专一性太强.
　　胱氨酸和赖氨酸衍生物荧光信号较弱,这些都是该法的不足之处。在后来发展的氨基酸柱前衍生方法中,OPA与巯基试剂,通常是与β-巯基乙醇(β-MCE)连用,在碱性条件下一级胺反应迅速(30s)产生荧光产物1-巯代-2-烷基-异吲哚(λEX=340nm,λEM=450nm)。衍生物很适于HPLC分离。β-MCE作巯基试剂时Asn/Ser、Val/Met分辨率较差,近来有用3-巯基丙酸(3-MPA)替代它,借引入一个α-羧基,使这两对氨基酸衍生物疏水性相对减弱,再用乙腈替代甲醇,即可使其完全分离[12]。OPA法主要缺点有:(1)亚氨基酸不能与其直接反应,需先氧化开环,如前所述。(2)荧光产物不稳定。虽然可使用自动进样器在色谱分析前混合样品与试剂,但技术较复杂,难以推广

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