氨基酸的紫外光检测

来源: 发布时间：2014-11-17  

　　紫外光检测,是通过使氨基酸与衍生试剂发生反应,生成的氨基酸衍生物在紫外光光谱范围内有吸收,通过测定吸光度值,根据标准曲线从而得知被测氨基酸的含量。通常能使氨基酸生成在紫外光区有吸收的衍生试剂有邻苯二甲醛(OPA)、异硫氰酸苯酯(PITC)、6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺氨基甲酸酯等。
　　OPA(邻苯二甲醛—疏基乙醇)法早在1971年.Roth就提出了OPA衍生法.由于其灵敏度比茚三酮法高出10倍,故初作为一种柱后衍生剂,Jones等提出的衍生方法如下
　　OPA在2一巯基乙醇存在下与第一级氨基酸 迅速反应生成12硫代烷基异吲哚加成物可产生荧光,在紫外区也有较强吸收。它可用高灵敏度荧光检测,又可采用一般的紫外吸收检测。紫外检测波长为350nm,紫外检测线性范围为1×10-11～20×10-11mol。OPA本身不干扰分离与检测,不必除去过量试剂,色谱图基线也比较平稳。 OPA与氨基酸的衍生化反应需要在碱性环境下进行,早先用加有0.4mol/l的硼酸盐缓冲液(pH=10.4)来提供碱性环境。由于疏基乙醇带有强烈的气味.因此改用巯基丙酸来代替它。后者和前者作用相同且气味较小,具体试验条件如下:精称100mg邻苯二甲醛,加100ul琉基丙酸,用10ml的0.4mol/l的硼酸盐溶液溶解,得衍生化试剂。按1:1的比例和样品溶液混合,过滤,立即注入高效液相色谱仪进行分析,
　　因衍生化后的样品不稳定,久置后误差较大。如果要分析脯氨酸.因其是二级氨基酸,需用9—芴基甲酰氯(FMOC)进行衍生化。 OPA大的缺点是:(l)不能与带有仲胺基团的脯氨酸或羟脯氨酸反应.因此做氨基酸全谱分析时需配以其它技术(如与FMOC等衍生剂一起使用)。(2)OPA的氨基酸不稳定,特别是甘氨酸,赖氨酸衍生物的信号衰减很快,此法多用干全自动的在线衍生。3.2.2 异硫氰酸苯酯(PITC)苯乙内酰硫脲氨基酸衍生物(PTH-AA)用于蛋白质中氨基酸的序列分析已30多年,此衍生物非常稳定,适于RP-HPLC分离,分析速度快(10min)。但用此法衍生时一些氨基酸如Ser、Thr、Arg、His需用与大多数氨基酸不同的方法处理。步骤复杂,时间长,有时需要1d,很不理想。目前在做氨基酸组分分析时,已被分析苯氨基硫甲酰衍生物(PTC-AA)的PTC法替代。PTC-AA是产生PTH-AA的中间产物,只在Koop等确定了它的稳定性后才直接用于氨基酸分析。
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